高时间分辨率蛋白质组图谱发布 | 全面揭示iPSCs向肝细胞分化分子机制
作为药物代谢和毒性评估的金标准，人原代肝细胞（PHHs）显著降低了动物试验的科研需求，但其广泛应用仍受到PHHs相对稀缺、体外培养潜在变化丰富及不同供体间变异高等因素的限制。也因此，关于人诱导多能干细胞（iPSCs）分化而来的肝细胞样细胞作为PHHs替代的研究也越来越多。
当前大多数研究还是集中在肝细胞分化过程中少数重要的mRNA或蛋白质的表达量分析上，而具体的分子机制仍不清晰。由于大多数生物过程在蛋白质水平上受到调节，并且通常需要翻译后修饰（PTM）来控制代谢和其他细胞活动，因此从蛋白质水平分析肝细胞分化的过程显得十分重要。近日，德国慕尼黑工业大学一研究团队对iPSCs向肝细胞分化不同阶段的定量蛋白质组学和修饰蛋白质组学进行了深入的分析研究，绘制了一个综合的蛋白质组学图谱。
iPSCs向肝细胞分化的高时间分辨率综合蛋白质组图谱
该研究根据已发表的方案，使用从人类皮肤分离的TkDA3–4 iPSCs进行两次独立的向肝细胞的分化。选第0天（iPSCs）、第6天（DE[定型内胚层]）、第8天（HE[肝内胚层]）、第13天（IH[未成熟肝细胞]）和第21天（MH[成熟肝细胞样]）的样本进行定量蛋白质组学和修饰蛋白质组学（磷酸化和乙酰化）分析，磷酸化和乙酰化肽段分别用Fe3+-IMAC柱和乙酰基赖氨酸抗体进行富集。每个阶段的样本均使用TMT标记定量进行蛋白质组学分析，共鉴定到9,000种蛋白质，12,000个磷酸化位点及800个乙酰化位点，绘制了一个iPSCs向肝细胞分化的综合蛋白质组图谱。
图1 iPSCs向肝细胞分化的高时间分辨率蛋白质组、磷酸化蛋白质组和乙酰化蛋白质组分析
iPSCs向肝细胞分化不同阶段的蛋白质组和转录组相关性分析
利用iPSCs不同分化阶段marker基因的qPCR数据、蛋白质组学数据和公开的scRNA-seq（单细胞RNA测序）数据进行关联分析，发现每个阶段的蛋白质和转录水平的相关性都很低，相邻分化阶段的蛋白质或转录数据的fold change比率的相关性甚至更低，表明转录本丰度和蛋白质表达量之间的时间动态差异巨大。反而是相距最远的iPSC和HM阶段的蛋白质和转录水平相关性更强，表明转录本丰度在某种程度上可以代表指代蛋白质表达量，但仍不足以揭示蛋白质水平的时间动态变化，蛋白质组数据则更好的展示了不同分化阶段的时间动态。
图2 不同分化阶段marker基因的qPCR、scRNA-seq和对应的蛋白质组结果热图
不同分化阶段的分子特征
通过筛选差异表达蛋白质，寻找各分化阶段的蛋白质标志物，共筛选到78个标志物，其中52个为MH阶段特有，并且大多数标志物均集中在iPSC和MH，而在分化中间阶段标志物则较少，可能与中间阶段细胞异质性高有关。
聚类分析发现从HE向IH分化阶段的多个差异表达蛋白显著富集在三羧酸循环等代谢通路中，表明此阶段存在一个显著的代谢转换；多个分化成熟阶段的蛋白标志物的表达量增加先于细胞的代谢转换，表明代谢转换是细胞成熟的结果。
KEGG分析结果显示，尽管在iPSCs分化的早期阶段就检测到参与DNA复制相关基因的转录水平降低，但相关蛋白水平的降低直到分化后期才较为明显。相对的，细胞周期关键调节因子CDK1在分化早期并未发生蛋白表达量水平的显著变化，而是其161位苏氨酸（T）的磷酸化水平降低，影响了其与CCNB1的结合，最终影响了G2/M进程。表明某些细胞周期相关蛋白的活性受到的修饰水平调节先于表达量水平调节。
图3 蛋白质表达和磷酸化水平调控细胞周期检查点模式图
iPSCs分化肝细胞样细胞评估
为了评估iPSCs不同供体间的变异程度，使用3个不同的供体进行独立的分化，并将取样时间点增加到12个，相应的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学图谱具有相似的分子特征，表明供体间蛋白质水平差异不大。
相似地，通过对LB培养液3D培养与2D单层培养的iPSCs进行蛋白质组学的研究，发现3D培养的细胞分子特征更接近PHHs。但3D培养细胞和PHHs两者之间在药物吸收、分布、代谢和毒性等相关蛋白的分子特征上仍存在很多差异。
图4 肝细胞分化路线图
总之，该工作获得了高时间分辨率下肝细胞分化过程中的综合蛋白质组图谱，对iPSCs向肝细胞分化各个阶段的代谢途径和蛋白质动态变化的研究补充了这些过程的功能特征。此外，获得的数据集证实了3D培养模型相比于2D单层培养模型的优势，并揭示了这些系统与人原代肝细胞相比仍存在的缺陷。该研究提供的具有高时间分辨率和蛋白质组学深度的数据，将有助于相关研究者开发和改进诱导iPSCs分化的策略。
特别地，该工作通过定量蛋白质组和修饰蛋白质组分析，发现肝细胞分化早期的蛋白磷酸化修饰水平变化明显早于表达量的变化，足见仅在蛋白表达量水平的分析并不全面，需结合修饰蛋白质组学的分析来充分客观地揭示科学问题。
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